mirna靶基因分析（mirna靶基因分析套路）

如何预测和鉴定miRNA的靶基因

免疫沉淀

当然，确定miRNA与mRNA之间的互作，我们还有更直接的方法，那就是从实验上寻找物理相互作用。我们可以利用RNA诱导沉默复合物（RISC）中的Argonaut（AGO）蛋白的抗体进行免疫共沉淀（co-IP）。生物通

目前更先进的方法是通过紫外线照射以交联复合物，然后开展深度测序以鉴定发现的RNA，这种方法被称为紫外交联免疫沉淀结合高通量测序（HITS-CLIP），或CLIP-seq。利用这种方法来寻找miRNA的靶基因，能够明显降低miRNA结合位点的假阳性预测率，并且缩小miRNA结合位点的空间范围，可在全基因组范围内鉴定AGO蛋白与不同RNA上的结合。现在有多家公司提供CLIP-seq服务，如锐博生物。

Clontech公司（Takara旗下）也推出了一种新工具，能协助鉴定细胞中的miRNA靶点。这一工具名为MirTrap系统。它利用RISC蛋白的显性失活突变体，允许miRNA与其目标结合，但限制进一步的加工。此亚基整合到内源的Argonaute/RISC复合物中，并“锁定”miRNA-目标mRNA。显性失活亚基上的DYKDDDDK（FLAG表位）标签有助于整个Ago/RISC复合物的捕获和分离。这样就能实现miRNA及其目标的免疫沉淀，从而通过新一代测序或定量PCR来鉴定或定量。

怎样研究mirna及靶基因的功能

木薯(Manihot esculenta Crantz)属于大戟科木薯属植物，典型的热带作物。低温是木薯获得高产优质的限制因子，microRNA(miRNA)作为逆境胁迫诱导的主要调控因子之一在木薯抗寒机制中占有重要地位。miRNA是一类长度约为21～25nt的非编码小RNA，它能识别特定的靶mRNA并在转录及转录后水平有负调控基因的作用。本研究旨在通过表型鉴定方法和分子生物学技术相结合共同探讨木薯抗寒基因的调控机理。

通过对术薯C4和SC124品种在低温胁迫处理下的形态生理指标监测和7个miRNA及4个靶基因的实时定量表达分析和功能分析，得出如下结论：

(1)在低温胁迫处理下，木薯的叶片数、叶绿素含量、脯氨酸含量和丙二醛含量变化显著，且这些指标变化与木薯叶片出现的冷害褐斑及叶片萎蔫程度等表型变化相一致。低温驯化(AH)和非低温驯化(NAH)的各项指标表明低温驯化能增强木薯的低温适应能力及恢复能力；同时也证实了C4比SC124具有更强的耐寒性。

(2)实时定量分析表明木薯中的7个miRNA受低温诱导表达，且它们在C4，和SC124品种中及不同的低温处理方式下都具有差异表达；其中2个miRNA(miRNA1045125和miRNA3747522)的靶基因在两品种和不同低温处理方式下也具有差异表达。

(3)通过对2个miRNA和它们靶基因的定量表达分析发现，无论在C4和SC124品种中还是不同低温处理条件下，2个miRNA与它们的靶基因之间都有明显的此消彼长的负调控作用；且4个靶基因在两个品种之间具有相反的表达模式。

(4)将miRNA1045125和miRNA3747522的4个靶基因在拟南芥和蓖麻基因组数据库中进行比对，它们在拟南芥和蓖麻中的主要功能是解旋酶、核酸酶、运载蛋白等。

如何预测一个新基因是否是miRNA的靶

如何预测和鉴定miRNA的靶基因 miRNA sponge抑制载体，经特异地优化设计，增强吸附能力的同时增加了更多的结合位点，这样提高了成熟miRNA或siRNA抑制能力，消弱细胞中miRNA或siRNA导致的基因沉默效应，从而进行miRNA或siRNA功能缺失性研究。 MiRNA sponge载体与化学修饰的反义寡核苷酸相比，有它无可比拟的优势：a. 由于miRNA sponge是由质粒编码的，可以反复使用；b. 它能够通过包装慢病毒颗粒达到稳定沉默细胞microRNA的细胞系，有利于进行对原代细胞和难转染细胞miRNA的抑制； c. 能够沉默整个家族的microRNA以达到对整个家族microRNA功能的研究； d. 可以利用miRNA sponge实现体内外loss of function研究；e. 可以用来检测luciferase靶基因报告系统分析；f. 可以自由组合串联不同miRNA抑制子序列，达到沉默多种不同miRNA的目的。