lncrna引物设计（环状rna引物设计）

LncRNA 过表达慢病毒载体引物设计

构建 lncRNA 过表达质粒或者慢病毒、腺病毒包装载体。原则上是将全长lncRNA 定向克隆到表达载体上实现 lncRNA 的过表达。然而有些 lncRNA很大或全长尚未分离，这时将视 lncRNA 在基因组上的定位采取不同的研究策略。在构建 lncRNA 表达质粒时，需关注 lncRNA 是否在蛋白编码基因的启动子区域或 3 ′-UTR 区域 ，勿遗漏重要区段。

引物设计是载体构建的第一步，也是最关键的一步，这直接决定了后续实验能否进行下去。引物设计完成后的具体操作步骤见后文。 文章正在审核中... -

1.    选择合适的载体，依据实验室现有的条件进行选择：plvx-puro，Amp，puro，其他慢病毒载体的原理相似，例如pLenti-puro等

2.    找到基因的CDS区，复制；对于LncRNA，则直接选择全部序列即可

3.    用primer5找到 目的基因上没有 and 载体有 的酶切位点

4.    确定酶切效率，在酶边是否需要加保护碱基以提高效率

5.   Kozak序列（针对表达蛋白的载体，而对于L过表达载体，则不需要RNA）

6.   取目的基因CDS区两端15~21个碱基（或反向互补链），加上酶切位点和kozak。当然，这个范围可以放宽。

操作步骤：

①  在NCBI找到基因序列，复制ORIGIN区。

②  打开primer5软件，将序列复制到到中间的框内

③点击Enzyme

点击OK，得到该基因所包含的酶切位点数据。

④ 分析载体质粒的酶切位点，这里用pLvx-puro作为目的基因的载体

因此，BamH1、EcoR1不可使用，其他可用的有：

Xho1、BsyB1、Apal、Smal、Xbal

酶切的选择还需要考虑现实情况，我们组内有现货的酶： Xho1, Xbal。

在目的基因的上下游截取15-21bp序列，点击Primers里的Add primers,根据经验选取Tm值在50-60℃左右，在上述范围内选取合适的bp。

选择“引物”，“添加引物”，先设计上游引物：输入上游18bp碱基后，再插入XhoI位点：

得到 CTCGAG GCTGCTGCCACGTAAGAA

再设计下游引物：因下游3’端有连续22个A，若算入，则Tm值和GC含量均不达标。因此，在引物设计时，去掉尾部部分A序列，输入尾部序列，点击“反向互补序列”，插入XbaI位点，得到TTTTTGTTTGACTTTGTGTTTATTTTTAAT，Tm=50℃。

查找保护碱基，随便百度都能搜到。

①因此XhoI酶切位点处的上游引物为：对于LncRNA来说，不需要起始密码子，不需要Kozark序列，但是需要防止误翻译。

保护碱基+酶切位点+一小段目的基因

CCG CTCGAG CGG GCTGCTGCCACGTAAGAA，67%GC,Tm56℃

②XbaI酶切位点对应的下游引物为：

保护碱基+酶切位点+一小段目的基因

若是加上A尾，GC TCTAGA GCTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTTTGACTTTGTGTT

若是不加A尾GC TCTAGA GCTTTTTGTTTGACTTTGTGTTTATTTTTAAT。

对于一些过长的基因来说，直接通过两端的上下游引物，是无法扩出合适的cDNA的，因此可以选择将基因分段扩增，再进行连接。

例如up主所研究的基因是6810bp，之前已经合成了1-3010长度的质粒，因此现在只要合成后半部分，再进行DNA连接即可。

因为本组已有一个1-3010，两端酶切位点分别为 BamHI 和 XhoI 的pcDNA3.1载体，因此可以设计从3011开始，以XhoI作为末端的上游引物： CCG CTCGAG CGG AAAATTAGGTTTATTCAAGC。

因此，可将pcDNA3.1-AFAP1-AS1以 BamHI/XhoI 做酶切得到1-3010片段，

以引物扩增后的cDNA以XhoI和XbaI做酶切即可得位点为 XhoI/XbaI 的3011-6810片段，再连接在一起可得全长full-length序列，位点为 BamHI/XbaI 。

再将plvx载体以BamHI和XbaI做酶切，与上述cDNA相连，即可得出plvx-AFAP1-AS1-full-length。

详细的载体构建的操作步骤、注意事项等，可见于 载体合成步骤 -

对于其他过长的载体，建议各位可以采取类似的方法，分段酶切、再连接。这时要注意引物的选取。

接后续：阿婆主的6800bp载体做成了，直接从细胞的RNA里扩全长没成功，估计是因为实在太长了！

后面试了，分成了3000+3800两个片段来做，可成功！！！

过表达载体合成步骤

本文将介绍骨架载体+目的基因序列合成方法

在合成之前，应该先确定骨架载体 backbone+基因 序列。其中，骨架载体是根据自己的实验需要来决定。

在进行PCR之前，需要 ① 先针对自己的基因设计对应的 引物； ②提取与所需表达的基因同源的细胞或组织中的RNA，并经过RT程序将其转化为 cDNA； ③PCR扩增 出 所需要的基因片段。

引物设计部分可参照前文。 LncRNA 过表达慢病毒载体引物设计 -

PCR扩增的步骤及原理 1. 模板DNA的 变性 ：模板DNA经 加热 至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2. 模板DNA与引物的 退火（复性） ：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3. 引物的 延伸 ：DNA模板－引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性、退火、延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

经常用的DNA聚合酶有 耐高温的Taq酶 ，买的同时会附送10×buffer(主要成分是KCl、Tris-HCl和MgCl2，有些还有(NH4)2SO4)

拿到引物后最好先高速离心，12000rcf, 4°C离心2min，再加DEPC水溶解，置于-20℃保存，可适当分装。

2XPhanta max master mix ：25ul

F：1ul（20uM）

R：1ul（20uM）

cDNA：23ul（1ug RNA逆转录后，再稀释10倍）

反应程序：

①95℃ 3min，② 95℃ 15s→60℃ 15s→72℃ 1000bp/min (30个循坏，不能多），③72℃ 10min，④4℃ (持续）。

退火温度的选取 ：通常情况下，可以尝试用 两条引物中较低的Tm值减去5℃ 来作为退火温度，但是这种方法有时候会不适用，在不适用的情况下可以考虑做12个退火温度，这样试下去，总会找到合适的退火温度。

配胶： 琼脂糖凝胶浓度选择 ：脂糖的浓度，这部分参数是根据目的片段的大小选择的，一般500bp以下选择1.2%-1.5%（质量体积比）500bp-10kb可以选择0.8%-1%，分子量再高的话琼脂糖浓度就再低点。胶的配置：1X  TAE + 琼脂糖粉 + Gel Red

本实验中，有两种大小的的目的序列，过表达：①6810bp；②3800bp；敲低序列：③15~20bp。因此要配置1.5%的琼脂糖，跑敲低序列的cDNA；配置0.8%的琼脂糖，跑过表达的序列。

电泳 ：样品中加入DNA loading buffer，上样，样品在负极，电泳条件：120V 40min 电泳。注： 胶的浓度越低，跑的电压最好也相应地变低，并增加电泳时间。这样可以防止条带跑成一个U型 。

胶回收 ：跑完DNA电泳后，使用手持紫外灯切胶，用胶回收试剂盒回收cDNA。

①过表达全长：使用 XhoI 和 XbaI 对 plvx-puro 质粒做双酶切；对上游引物1和下游引物1引出的cDNA以同种酶做双酶切。

②过表达半长：使用 BamHI 和 XbaI 对 plvx-puro 质粒做双酶切；使用 XhoI 和 XbaI 对上游引物2和下游引物2引出的cDNA做双酶切；再用 BamHI 和 XhoI 对pcDNA3.1-AFAP1-AS1质粒做双酶切（注：这一步是因为答主已经做出来了1-3010片段，前半段的设计和后半段的设计原则一样，在此不再赘述）。

一共30uL体系，需要 按照次序加入 ，最好不要改变顺序！！！

①无酶ddH2O 或DEPC：补足至30uL

②plasmid：体积=3~5ug/质粒浓度

③10X cutsmart：3uL

④限制性内切酶1：2uL

⑤限制性内切酶2：2uL

注：以上酶切是为了做胶回收，如果仅仅是双酶切验证，可将质粒改成1ug，内切酶仅需0.5uL，总体系10uL即可。毕竟内切酶也很贵啊！

①载体： 载体浓度在20-100 ng/uL最好， 体系内总量50-100 ng 即可。如果所选载体多克隆位点上的俩个酶切位点比较近，甚至相邻，最好分步酶切载体，比双酶切效果好的多。

②总体积 ：通用10-15 uL

③载体和插入片段比例： 一般是1:3，如果很难连接，比如说平端连接，要适当 提高载体浓度 ，同时 加大比例1:10

④大片段相连: 越大的片段越难连接，可采用方法a.减小反应体系，以提高反应体系中载体和插入片段的浓度；b.适当增加T4的用量；c.对大片段分成几个小片段，再依次连接到载体上，两两相连。

⑤ 多片段相连 ：多片断的连接最经常的做法是 顺次俩俩连接（目的片断和载体片断的连接）， 采用载体上的多克隆位点，此时应注意酶切位点的 顺序 。

千万要注意，不能直接把目的片段ABC连一起，而应该依次把目的片段依次克隆到载体上去，否则就会出现下图中的结果：出现很多条不明确条带（ 末端自连 导致的）

注意所有片断两端的酶，是否存在 同尾酶 和 同裂酶 ，例如BamHI和Bgl II是同尾酶，Sal I和Xho I 是同尾酶； 同尾酶-百度百科 ， 同裂酶-百度百科 。

质粒酶切回收大片段与目的基因连接，连接反应在16℃反应过夜。DNA连接体系可根据本组使用的酶说明书来确认。

取10ul连接产物与50ul 感受态细菌（对于 慢病毒载体 ，最好选择 stable3菌株 ，更有利于质粒稳定；而对于原核表达的载体，最好选择Rosetta菌株）混匀后冰浴30min，42℃热激90s，立即置冰上放置5min,加入预热至室温的500ul LB培养基， 37℃恒温培养60min，吸取 200ul的菌液，用移液器混匀后均匀涂布于含50ug/ml Ampicillin 抗性（ 根据骨架载体的特征来选，这里用的是pLvx质粒，因此选Amp）的LB平板上， 37℃恒温培养箱倒置培养过夜。

挑取5个单菌落接种于含5ml，载体对应抗性的LB培养液中，200rpm，37℃恒温摇床培养过夜，用质粒小量提取试剂盒提取质粒，再进行 双酶切验证、测序验证 。

lncRNA逆转录的引物如何设计啊?是用随即引物吗?

目前发现的大多数lncRNA都带有poly(A),可以通过Oligo(dT)、随机引物进行反转录扩增合成cDNA

lncRNA逆转录的引物如何设计啊？是用随即引物吗

lz说的是下游引物吧，下游引物是针对反转录时的茎环引物设计的；lz首先要知道你的反转录引物的序列，然后设计与反转录引物的非茎环配对的下游定量引物，上游引物则是特异性结合mirna的引物