编码本发明所述氧化氢氧化氢荧光探针的核苷酸序列(组图)

的宿主细胞。

本发明还提供了该基因编码过氧化氢荧光探针在检测H2O2中的应用，包括在大肠杆菌中的应用和在哺乳动物细胞中的应用。

编码本发明的氧化氢荧光探针的核苷酸序列选自Seq ID NO 7所示的HyPer-N337T、Y131F、S262R、Seq ID NO 9所示的HyPer-N337T、Y131F、Y271N、Seq ID NO 11 m*- S262R、Y271N、Y131F、N337T、13m*-N337T、Y131F、S262R、Seq ID NO 15、Y131F、Y271N、Seq ID NO 17-N337T、Y131F、S262R、Y271N。

本发明中用于表达H202的荧光蛋白序列可以来源于维多利亚多管发光水母的荧光蛋白( )及其衍生物，主要是指环状重排黄色荧光蛋白(cpYFP)，如SEQ ID NO: 5.

本发明提供的表达载体，其包含与表达控制序列可操作连接的本发明核酸序列。表达控制序列可以是复制起点、启动子、增强子、操纵子、终止子、核糖体结合位点等。

本发明提供的荧光探针或融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

一个。将本发明的表达载体转移到宿主细胞中，

湾。在适合宿主细胞表达的条件下培养宿主细胞，和

C.通过所述宿主细胞分离所述荧光探针或融合蛋白。

本发明还提供了所述荧光探针在检测过氧化氢中的应用。在一个实施例中，本发明提供了荧光探针在检测活细菌中H 202 中的应用。在一个实施方案中，本发明提供了荧光探针在亚细胞水平检测H 2 O 2 中的用途。

发明详述

一、定义：

当给出一个值或范围时，本文所用的术语“约”是指该值或范围在给定值或范围的20％以内、10％以内和5％以内。

如本文所用的术语“包含”、“包含”及其等同物包括“包含”和“由...组成”的含义，例如“包含”X的组合物可以仅由X组成或可以包含其他物质，例如X +Y。

在本发明中，术语“HyPer”是指已报道的基因编码过氧化氢荧光探针，是将cpYFP蛋白插入OxyR-RD中，并在中间连接一条短氨基酸链。

如本文所用，术语“HyPer蛋白突变体”或“HyPer突变体”或“合理设计的HyPer突变体”是指分别在HyPer探针的cpYFP元件上的相应位点引入突变位点，继续在突变体中引入荧光增强，直到获得具有最高荧光强度的突变体。本发明涉及的“HyPer突变体”可以包含SEQ ID NO：8、10、12、14、16、18的氨基酸序列。

本发明的S262R是将第262位的氨基酸“S”改为“R”，Y271N是将第271位的氨基酸“Y”改为“N”，Y131F是将第271位的氨基酸“Y”改为“N”。第131位“Y”突变为“F”，N337T是将第337位的氨基酸“N”突变为“T”。

本发明对HyPer过氧化氢荧光探针做了很多突变体，筛选出可以在活菌、亚细胞水平检测H2O2，探针特异性好，部分荧光强度更强的探针进行了专利申请，该探针克服了由于探针的荧光强度较弱，限制了对细胞内 H2O2 准确检测的问题。

[0052] 如本文所用，术语“GFP”是指绿色荧光蛋白，其最初是从维多利亚水母中提取的，由238个氨基酸组成，分子量约为26kDa。GFP由12条β折叠链组成，形成独特的桶状结构过氧化氢检测方法，被发色团三肽（Ser65-Tyr66-Gly67)包裹。在氧气存在下自发形成对羟基）。亚苄基咪唑啉酮的发色团结构产生荧光。GFP不需要辅因子产生荧光，荧光非常稳定，是一种很好的成像工具。GFP有两个激发峰，在395nm的主峰可以产生508nm的发射光，当肩峰的激发光为475nm时产生503nm的发射光。

本文使用的术语“cpFP”是指环状重排的荧光蛋白，该蛋白最早来源于绿色荧光蛋白GFP过氧化氢检测方法，其氨基酸序列与GFP同源性高达90%以上。它通过一条柔韧的短肽链连接GFP原有的N端和C端，并在野生型GFP发色团附近的位置（如Y144和N145氨​​基酸）产生新的N端和C端）。氨基酸 145-238 用作新蛋白质的 N 端，原始氨基酸 1-144 用作新蛋白质的 C 端。两个片段由5-9条柔性短肽链连接，如GGSGG等，形成对空间变化敏感的环状排列的黄色荧光蛋白cpGFP（SEQ ID NO5)）。

本文所用术语“荧光动态变化”或“荧光变化”或“荧光变化倍数”是指荧光蛋白探针结合配体后荧光强度的变化，该荧光变化可根据荧光蛋白蛋白质探针。针的光谱特性分为单通道变化或双通道变化。具有单通道荧光变化的探针，如基于cpBFP、cpGFP、cpTFP和cpRFP的探针，当这些探针与配体结合时，其发射荧光强度会增加或减少，这种增加或减少的倍数可以称为“荧光变化”。如果荧光探针蛋白是基于cpYFP的，它可能有两个激发峰。当探针与配体结合时，其发射光在不同激发光下的荧光强度可能会增加或减少。比率变化，也称为“荧光变化”，是通过除以 的荧光变化获得的。荧光变化越大，探针的性能越好，越有可能用于细胞内检测。

[0055] 如本文所用，术语“实时检测”或“时空特异性检测”是指荧光蛋白探针可以实时跟踪细胞内特定空间的事实。当将含有具有特定定位信号的荧光蛋白探针的质粒引入细胞时，它可以表达并驻留在细胞的特定区域。在荧光显微镜等观察方法下对细胞进行连续成像，将获得的图像转化为细胞内的配体信号，从而在空间和时间上特异性地检测细胞内的检测对象。

[0056] 本发明中使用的术语“变体”、“突变体”或“衍生突变体”包括与多肽或蛋白质具有相同功能但序列不同的变体。这些变体包括（但不限于）： 多肽或蛋白质1-10序列中一个或多个（通常为1-30，优选1-20，更优选1-30）的缺失、插入和/或替换，最佳1-5)个氨基酸，并且在其羧基末端和/或氨基末端添加一个或多个(通常在20个以内，优选在10个以内，更优选5个)a)获得的氨基酸序列。例如，在本领域中，用具有相似或相似性质的氨基酸进行取代通常不会改变多肽或蛋白质的功能。在艺术上，具有相似性质的氨基酸通常是指具有相似侧链的氨基酸家族，这在本领域已经明确定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸（例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、具有酸性侧链的氨基酸（例如，天冬氨酸、谷氨酸）、具有侧链的不带电荷的极性氨基酸（例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺） 、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、具有非极性侧链的氨基酸（例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸）、具有β支链侧链的氨基酸（例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和带有芳香侧链的氨基酸（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）。

如本文所用，术语“功能片段”、“衍生物”、“突变体”和“类似物”是指保留与通过本发明的合理突变产生的“HyPer突变体”基本上相同的生物学功能或活性的那些。蛋白质。通过本发明的合理突变产生的“HyPer突变体”的功能片段、衍生物、突变体或类似物可以(i)具有一个或多个保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)取代的蛋白质。根据本文的教导，这些功能片段、衍生物和类似物为本领域技术人员所熟知。

[0058] 通过合理突变产生的类似物和“HyPer突变体”之间的差异可以是氨基酸序列的差异，或不影响序列的修饰形式的差异，或两者。这些蛋白质包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变体可以通过多种技术获得，例如通过辐射或暴露于诱变剂的随机诱变，以及通过定点诱变或其他已知的分子生物学技术。

[0059] 本发明中使用的术语“核酸”可以是DNA或RNA的形式。DNA 形式包括 cDNA、基因组 DNA 或合成 DNA。DNA可以是单链或双链的。如本文所用，关于核酸的术语“变体”可以是天然存在的等位基因变体或非天然存在的变体。这些核苷酸变体包括简并变体、替换变体、缺失变体和插入变体。如本领域已知的，等位基因变体是核酸的替代形式，其可以是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但基本上不改变其编码的蛋白质的功能。本发明的核酸可以包含与核酸序列至少约70%的序列同一性，

[0060] 本发明的荧光探针或融合蛋白或其片段的全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成法获得。对于PCR扩增方法，可以根据本发明公开的相关核苷酸序列，特别是开放阅读框序列设计引物，可以使用市售的cDNA文库或通过本领域技术人员已知的常规方法制备的cDNA。该文库用作扩增相关序列的模板。当序列较长时，往往需要进行两次或多次 PCR 扩增，然后每次扩增